NK細(xì)胞活性檢測(cè)方法
NK細(xì)胞是一種異質(zhì)性、多功能的細(xì)胞群，具有抗腫瘤、抗感染和免疫調(diào)節(jié)功能，并參與移植排斥反應(yīng)和某些自身免疫性疾病的發(fā)生，因而通過制備NK細(xì)胞克隆對(duì)其功能進(jìn)行研究已受到人們的高度重視。測(cè)定人NK細(xì)胞活性多以K562細(xì)胞株作為靶細(xì)胞，而測(cè)小鼠NK細(xì)胞活性則用YAC細(xì)胞株，檢測(cè)方法多種多樣。
(一)形態(tài)法
將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按一定比例混合溫育，繼而用臺(tái)盼藍(lán)或伊紅Y等活細(xì)胞拒染的染料處理，然后分別計(jì)數(shù)著染的死細(xì)胞和不著染的活細(xì)胞，推算NK細(xì)胞活性。
1．材料
(1)靶細(xì)胞：K562細(xì)胞株或YAC細(xì)胞株。
(2)效應(yīng)細(xì)胞：NK細(xì)胞。
(3)含15％NCS的RPMI 1640培養(yǎng)液，5％臺(tái)盼藍(lán)染色液。
2．方法：
(1)效應(yīng)細(xì)胞的制備：將克隆的NK細(xì)胞用含15％NCS的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度至l×107／ml，備用。
(2)靶細(xì)胞的制備：取經(jīng)24h培養(yǎng)的靶細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌1次，1000r／min離心6min。棄上清液，用：RPMI 1640培養(yǎng)液重懸后計(jì)數(shù)，并用0．5％臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，活細(xì)胞數(shù)達(dá)95％以上時(shí)可用作靶細(xì)胞。以RPMI l640培養(yǎng)液調(diào)整至1×105／ml，備用。
(3)效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞作用：用40孔培養(yǎng)板，對(duì)照組1～3孔，每孔加100μl靶細(xì)胞，再加入RPMI 1640培養(yǎng)液100μl；實(shí)驗(yàn)組4～6孔，每孔加100gl靶細(xì)胞，再加入效應(yīng)細(xì)胞100μl，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例為50：1。混勻，置5％CO2 37℃孵箱中培養(yǎng)過夜。
3．結(jié)果分析取m培養(yǎng)板，將細(xì)胞輕輕混勻成懸液，從每孔中取出30μl細(xì)胞懸液，加等量O．5％臺(tái)盼藍(lán)染液混合。室溫下5min后，計(jì)數(shù)白細(xì)胞數(shù)。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組每孔各計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，分別記錄死亡細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，求出各組NK細(xì)胞活性的均值。
(二)酶釋放法
將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按一定比例混合溫育，離心沉淀，取上清液檢測(cè)靶細(xì)胞遭破壞后釋放出的酶含量。
(三)熒光法
用熒光素標(biāo)汜靶細(xì)胞，經(jīng)與效應(yīng)細(xì)胞共溫后，離心去上清液，用熒光計(jì)檢測(cè)剩余的活靶細(xì)胞的熒光。
(四)核素法
將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按一定比例混合共溫后，離心檢測(cè)上清液或剩余靶細(xì)胞放射性的量，間接反映其活性。有靶細(xì)胞胞漿釋放法和胞核釋放法兩種。
(五)化學(xué)發(fā)光法
當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞接觸時(shí)，效應(yīng)細(xì)胞呼吸暴發(fā)，生成極不穩(wěn)定的O 2-及OH一，放出光子，在發(fā)光劑存在條件下，可被光電倍增管接受和計(jì)數(shù)，發(fā)光量與NK細(xì)胞殺傷能力相關(guān)。
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