分離血管內(nèi)皮細(xì)胞的常用方法
內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell)在全部血管內(nèi)面構(gòu)成單一扁平上皮細(xì)胞層，呈多邊形，細(xì)胞的邊緣呈鋸齒狀，相互嵌合。用酶消化法或機(jī)械刮脫法等可將內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞分離，分離的內(nèi)皮細(xì)胞可在培養(yǎng)的條件下生長(zhǎng)。
一、原代培養(yǎng)法
(一)灌注消化法
1．材料
(1)標(biāo)本：兔主動(dòng)脈。
(2)試劑和藥品：PBS、0．05％、培養(yǎng)液、、、0．1％纖維連接蛋白、1．5％明膠。
(3)儀器和材料：手術(shù)刀、解剖剪、解剖鑷、止血鉗、眼科剪、眼科鑷、刀片、培養(yǎng)
皿、培養(yǎng)瓶、倒置顯微鏡、CO2孵箱、恒溫振蕩器。
2．方法
灌注消化法能夠獲得純度較高的內(nèi)皮細(xì)胞，是分離血管內(nèi)皮細(xì)胞的常用方法。
(1)取血管：在無菌條件下取出兔主動(dòng)脈，用PBS沖洗血管腔，洗去血液。
(2)消化內(nèi)皮細(xì)胞：將血管放入培養(yǎng)皿中，從動(dòng)脈的一段插入靜脈置留針．結(jié)扎固定，然后用絲線將另一端結(jié)扎。通過靜脈置留針向血管內(nèi)注入消化液，至血管充盈為止。在37℃條件下，消化10～15min。
(3)洗滌細(xì)胞：在血管的游離端切口，收集消化液，然后用10ml培養(yǎng)液沖洗管腔。將消化液和沖洗液離心(1000r／min,10min)。吸去上清液，用培養(yǎng)液混懸細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。
(4)包被培養(yǎng)容器：在平皿或培養(yǎng)瓶底部鋪纖維連接蛋白，鋪勻后靜置片刻，吸去剩余液體即可。也可鋪明膠，培養(yǎng)過夜，去除多余明膠。
(5)接種細(xì)胞：調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為3×105／ml，向25ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)接種5ml，或直徑10cm的平皿則接種10ml。
(6)培養(yǎng)細(xì)胞：置37℃、C02孵箱中培養(yǎng)，每24h換液1次。以后每隔48h換液1次。約6d后細(xì)胞可融合成單層內(nèi)皮細(xì)胞。
3．結(jié)果觀察30min后內(nèi)皮細(xì)胞開始貼壁，細(xì)胞呈圓形或多邊形。12h后，可見細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，呈小簇狀。24h后，細(xì)胞生長(zhǎng)形成細(xì)胞群。1周后．每個(gè)細(xì)胞群相互融合形成單量．細(xì)胞呈卵石狀排列。
4．注意事項(xiàng)向血管腔內(nèi)注入消化液時(shí)，應(yīng)防止消化液溢出，以免消化血管外膜，引起成纖維細(xì)胞的污染。
(二)酶消化法
1.材料
(1)標(biāo)本：兔主動(dòng)脈。
(2)試劑和藥品：PBS、0．2％膠原酶、培養(yǎng)液、、、O．1％纖維連接蛋白、1．5％明膠。
(3)儀器和材料：手術(shù)刀、解剖剪、解剖鑷、止血鉗、眼科剪、眼科鑷、刀片、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、倒置顯微鏡、c。2孵箱、恒溫振蕩器。
2．方法
(1)取血管：在無菌條件下取出兔主動(dòng)脈，放入盛有滅菌PBS的平皿中，剝除血管外的脂肪和纖維組織。
(2)暴露內(nèi)皮細(xì)胞：在盛有PBS的培養(yǎng)皿中，縱向剪開血管壁，然后沖洗。
(3)消化內(nèi)皮細(xì)胞：把血管放至盛有5ml膠原酶的平皿中，使血管內(nèi)膜面朝下，置37℃、CO2孵箱中消化10～15min，并多次搖動(dòng)平皿，以使內(nèi)皮細(xì)胞脫落。消化近結(jié)束時(shí)，可在倒置顯微鏡下觀察。若大部分內(nèi)皮細(xì)胞已脫落，則將消化液移入離心管中。
(4)洗滌細(xì)胞：離心(1000r／min，10min)，吸去上清液；再加入5ml PBS懸浮細(xì)胞，再離心，吸去上清液。加入5ml培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞。
(5)包被培養(yǎng)容器、接種細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞同灌注消化法。
3．結(jié)果觀察培養(yǎng)30min后，內(nèi)皮細(xì)胞貼壁。1周后，細(xì)胞生長(zhǎng)形成單層，呈卵石狀排列。
4．注意事項(xiàng)放入培養(yǎng)皿中的消化液不宜過多，避免消化內(nèi)皮以外的其他各層組織。
(三)機(jī)械刮脫法
1．材料
(1)標(biāo)本：兔主動(dòng)脈。
(2)試劑和藥品：PBS、培養(yǎng)液、、、O．1％纖維連接蛋白、1．5％明膠。
(3)儀器和材料：手術(shù)刀、解剖剪、解剖鑷、止血鉗、眼科剪、眼科鑷、刀片、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、倒置顯微鏡、C02孵箱、恒溫振蕩器。
2．方法
(1)取血管：按酶消化法摘取長(zhǎng)約20cm的大血管，在無菌條件下縱行剪開。
(2)洗滌血管：用PBS洗凈殘血，露出血管內(nèi)皮細(xì)胞。將血管固定在標(biāo)本板上，內(nèi)皮朝上，再用PBS沖洗2次。
(3)刮取內(nèi)皮細(xì)胞：用刮刀輕輕刮取內(nèi)膜表面的內(nèi)皮細(xì)胞。刮取時(shí)，刮刀與血管表面成60°，輕柔而均勻地推進(jìn)刮刀。每處只能刮1次，不可刮血管的邊緣。
(4)洗滌細(xì)胞：刮下的內(nèi)皮細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中，離心(1000r／min，10min)，吸去上清液；再加入15ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打，以便分散細(xì)胞團(tuán)，再離心1次，并吸去上清液。加入5ml培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞。
(5)包被培養(yǎng)容器、接種細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞同灌注消化法。
3．結(jié)果觀察30min后內(nèi)皮細(xì)胞開始貼壁，24h后，細(xì)胞生長(zhǎng)形成細(xì)胞群。1周后，細(xì)胞呈卵石狀排列。
4．注意事項(xiàng)刮內(nèi)皮時(shí)，不要過深和刮至血管斷面處，以免引起成纖維細(xì)胞污染。
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